laser

O efeito do laser de baixa potência 780-nm no processo de cicatrização muscular após criolesão.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do laser de baixa potência de 780nm em diferentes períodos de 7,14, 21 dias após criolesão, incluindo a dose (10 ou 50J/cm2), para promover um melhor reparo muscular evidenciado por  analise histopalogica e imunihistoquimica. 54 ratos do sexo masculino foram divididos em três grupos:  grupo lesão controle (CG) – animais lesionados sem tratamento; grupo lesionado tratado 780nm, 10J/cm2 (G10); e grupo lesionado tratado 780nm, 50J/cm2 (G50). Cada grupo foi dividido em três subgrupos (n=6): 7, 14 e 21 dias pós lesão.

Resultados histopatológicos revelaram uma melhor organização de fibras musculares  no G10 e G50 durante os períodos de 7 e 14 dias comparados com o CG.

O G10 e G50 durante 7 dias demonstraram redução significante (p<0.05) da área da lesão comparado com o CG, sem diferenças entre os grupos tratados por 14 e 21 dias.

O G10 mostrou um aumento na quantidade de vasos após 14 dias comparados com o G50, mas não em relação ao controle. No que diz respeito a analise imunihistoquimica  do fator MyoD, o G10 e G50 durante 7 dias mostraram maior concentração de immunomarkers do que o grupo controle. Myogenin immunomarkers fora similares aos observados nos dias 7 e 14 em todos os 3 grupos analisados,  enquanto que immunomarkers não foram encontrados em nenhum dos grupos após 21 dias de laserterapia.

Os resultados mostraram que o laser, independente da dose aplicada, possuem efeitos positivos no reparo muscular.

Introdução:
Lesão muscular é um trauma comum que pode causar dor e incapacidade, levando a uma deficiência  tanto para atividade ocupacional quanto de lazer. Varios mecanismos podem estar envolvido na lesão muscular: trauma direto (tensão, contusão ou laceração) e trauma indireto (isquemia e disfunções neurológicas), que são os mais comuns.

Isquemia (do grego ισχαιμία; isch- restrição, hema sangue) é a falta de suprimento sanguíneo para um tecido orgânico devido a obstrução causada por um trombo, seja ele formado por placas gordurosas ou por coágulos sanguíneos. Como osangue, através das hemácias (glóbulos vermelhos), leva o oxigênio às células, a isquemia resulta em falta de glicose e de oxigenação nas células (hipóxia).¹ O local mal oxigenado tende a ficar roxo e se não for tratado com urgência pode causar a morte.

Dilacerar: Rasgar em pedaços; despedaçar com violência:

Estudos tem demonstrado que o laser de baixa potência ajuda na reparação muscular e animais experimentais por agir positivamente na quantidade de fibras musculares, agiogenesis e formação de myotubos, assim acelerado o processo de reparo muscular.  Esses fatores são desejados na clinica prática para o tratamento de injúrias musculares extensas ou em populações com debilidade de reparo muscular. (idosos)

Entretanto, o mecanismo por qual ocorre a ação do laser na aceleração do reparo muscular não é ainda bem entendido. Portanto , é importante estudar o efeito da laserterapia em parâmetros histológicos e imunohistoquimico, assim permitindo o impacto terapêutico na agiogenese e fatores regulatório myogenicos (myogenic regulatory factors e.G MyoD and myogenin) para ser avaliado.

Adicionalmente, é possível observar que ainda não há consenso na literatura que considerem os melhores parâmetros para serem usados na terapia do laser de baixa potência.

Cressoni et al. Avalio o efeito do AlGalnP laser (785 nm) na regeneração muscular, reportando que durante a fase aguda, há uma diminuição da fase inflamatória, redução da quantidade de leucócitos na área lesionada e aceleração do reparo de tecido conjuntivo.

Rizzi et al. Observaram o efeito da aplicação do GaAIAs laser por 20J/cm2 no músculo masseter, reportando um aumento no metabolismo das fibras musulares.

Rizzi EC, Issa JPM, Dias FJ, Leão JC, Regalo SCH, Siéssere S,

Watanabe I, Iyomasa MM (2010) Low-level laser intensity application in masseter muscle for treatment purposes. Photomed

Laser Surg 28:31–35

Weis e Oron avaliaram o efeito  do HeNe laser (632.8 nm) na regeneração muscular de ratos, e encontraram no grupo irradiado uma recuperação mais rápida comparado com o grupo apenas lesionado  (não tratado).

Portanto, ainda estudos ainda são necessários para determinar os melhore parâmetros para a regeneração muscular, o que ira permiti a terapia com laser  de ser seguramente aplicada durante a prática clínica.

O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar o efeito do laser de baixa potência com comprimento de onda de λ=780 nm  em músculos em reparo após criolesão durante diferentes períodos de tratamento (7, 14 e 21 dias) por meios de analise histopatológica e immunihostoquimica.

Histopatologia: Histopatologia ou Histologia patológica é o estudo de como uma doençaespecífica afeta um conjunto de células (tecido). Geralmente é feito um estudo da biópsia (amostra de células coletadas da área infectada) usando um microscópio e corantes. Também pode ser feito durante uma cirurgia ou em uma autópsia (investigação da morte). Esse estudo pode ser feita em células de um animal, vegetal ou até mesmo de fungos. Para conservar as células geralmente elas são colocadas em uma solução de água com 10% de formol. Quando se trata de células humanas, o médico especialista que normalmente faz esse exame é o patologista. No caso de animais é pode ser feito por veterinários, biólogos ou outro profissional especialistas nessa área.

Imuno-histoquímica ou IHQ se refere ao processo de localizar antígenos (e.g. proteínas) em células de uma amostra de tecido, explorando o princípio da ligação específica de anticorpos a antígenos no tecido biológico.¹ O nome da técnica provém das raízes "imuno", em referência aos anticorpos utilizados no procedimento, e "histo", significando tecido (compare com imunocitoquímica). A coloração imuno-histoquímica é amplamente utilizada no diagnóstico de células anormais, tais como aquelas encontradas em neoplasias. Marcadores moleculares específicos são característicos de eventos celulares particulares, tais como proliferação ou morte celular (apoptose). IHQ é também amplamente utilizada na pesquisa básica para compreender a distribuição e localização de biomarcadores e proteínas diferentemente expressas em diferentes partes de um tecido biológico. A visualização de uma interação antígeno-anticorpo pode ser obtida de diversas formas. Na situação mais comum, um anticorpo é conjugado a uma enzima, como uma peroxidase, que pode catalisar uma reação que produzirá coloração. Alternativamente, o anticorpo pode também ser marcado com um fluoróforo, comofluoresceína, rodamina, Flúor DyLight ou Flúor Alexa 

Methods

Métodos:

Animals

54 ratos wistars (pesando 300 + 2-g) foram usados nesse estudo. Eles foram mantidos em controle em temperatura 22+2 graus celcius, 12 horas luz/escuro e acesso livre a água e comida comercial. Todos os animais foram manuseados no processo cirúrgico estritamente de acordo com o Guiding principle for the care and use of laboratory animals. Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade federal de são carlos.

Os animais foram distribuídos aleatoriamento em 3 grupos: grupo lesão controle (CG) – animais lesionado sem tratamento; lesionado – 780 nm grupo tratado com laser, em 10j/cm2 (G10); e lesionado 780 nm grupo tratado com laser, em 50j/cm2 (G50).  Cada grupo foi dividido em 3 subgrupos  (n=6), e em dias 7, 14 e 21 pós lesão,  e foram sacrificados. Tratamento iniciou 48h após a cirurgia e realizado a cada 24 horas durante 5, 10 e 15 sessões.

Projeto Experimental

Cirurgia

Os animais foram anestesiado com Ketamina (Dopalen 40mg/kg, IP; Vetbrands, São Paulo, Brazil) e o musculo tibial anterior (TA) direito exposto a criolesão. A criolesão baseou em dois ciclos de congelamento e descongelamento (freeze-thaw) no musculo in situ.

O congelamento envolveu a aplicação da extremidade plana de uma peça de ferro pré-resfriado em nitrogênio líquido, e foi mantido por 10 segundos no centro do músculo. O procedimento foi repetido 2 vezes consecutiva, com intervalo de 30 segundos. Finalmente, a pele foi suturada. ~

A criolesão causa lesão na células satélites, lamina basal, vasos sanguíneos e fibras nervosas, induzindo uma rápida e extensa necrose de miofibrilas, seguido de um processo de reparo relativamente lento.

LLT Protocol

Um laser de baixa potência GaAlAs laser, com  comprimento de onda continua de 780-nm , diâmetro do feixe de  4.0-mm2 , e dose de 10j/cm2 (20mW) e 50J/cm2 (40 mW) e tempo de irradiação de 20 e 50 seg ( energia total por ponto 0.4 e 2 J), respectivamente , foram usados nesse estudo. A irradiação foi realizada diariamente, em um único ponto, abaixo da área da lesão, através da técnica de “contato pontual’ (punctual contact) .

Em , 7 , 14 e 21 dias após a lesão, os animais foram sacrificados (com sedação profunda e overdose de Ketamina e Xilazina 0.5 ml cada) em ordem para extrair as amostras do musculo tibial anterior.  Esse intervalo de tempo pós lesão foram selecionados nessa ordem para avaliar o efeito do laser em diferentes etapas da regeneração muscular: a fase inflamatória, antes de 7 dias; a fase de reparo, entre 7 e 14 dias; e finalmente a fase de remodelamento, entre 14 e 21 dias.

Analise Histopatológica:

Os músculos obtidos de todos os grupos (experimental e controle) foram lavados imediatamento com solução salina, e para cada espécime, uma fixação foi realizada em 10%  de formalina tamponada (buffered), por 24h, seguido por desidratação em uma série graduada de etanol embebido em parafina.

Cross-section 5um (corte transversal ?)  do musculo TA foi preparado usando micrótomo.  Cinco secções de cada espécime  foi corado com hetamoxylin e eosina. Avaliação histopatológica foi realizada por uma patologista experiente (blinded to the treatment) 

A analise qualitativa considerou qualquer tipo de mudança no local da lesão, como a presença de processo inflamatório, tecido de granulação, área de necrose, degeneração focal ou difusa  miofibrilar e/ou de estrutura de tecido.

Não traduzi:

Morphometryc of the injured área

Number of blood vessels

Immunohistochemistry

Statistical analyses

RESULTADOS

Análise histopatológica

Na análise histopatológica, foi observada que 7 dias após a lesão, no grupo controle (CG) demonstrou grande quantidade de infiltrado inflamatório.

O grupo tratado com  laser 10 e 50-J/cm2 ( G10 e G50, respectivamente) possui pouca quantidade de infiltrado inflamatório e melhor organização do tecido muscular comparado com o grupo controle.

No décimo quarto dia após a lesão, os grupos tratados com -10 e 50J/cm2 , mostraram  mais tecido organizado quando comparado com o grupo controle (CG). Em 21 dias após a lesão, um reparo tecidual completo foi observado em todos os grupos (CG, G10 e G50)

Morfometria da área lesionada

A imagem 2 mostra a morfometria da área lesionada nos 3 diferentes períodos experimentais. O G10 e G50 durante 7 dias mostraram uma redução significante da lesão comparado com o CG, sem diferenças entre os grupos tratado por 14 e 21 dias.

Número de vasos sanguíneos

Em 7 e 21 dias após a cirugia, não foi encontrada diferenças estatísticas entre o grupo controle e tratados. No segundo período experimental,  um aumento estatístico do numero de vasos sanguíneos foram encontrados nos animais irradiados com 10J/cm2 comparados com o  de 50J/cm2

Imunihistoquimica

Expressão MyoD

Em 7 dias após al esão, a imunoexpressão MyoD foi observada nos 3 grupos experimentais, mas em maior quantidade nos grupos tratados com laser  de 10 e 50J/cm2.

No período de 14 e 21 dias após lesão, MyO imunoexpressão não foi detectada em nenhum grupo experimental.

O que é MyoD ?
Por que essa imunoexpressão foi observada apenas no período de 7 dias e não no  14 e 21 dias  ?

Expressão de Myogenin

Uma imunoexpressão de myogenin foi detectada após 7 e 14 dias após a lesão nos 3 grupos experimentais,

Em 21 dias após lesão, uma imunoexpressão negativa foi detectada no grupo experimental.

O que é Myogenin ?
Por que no período de 21 dias houve essa imunoexpressão negativa ?

DISCUSSÃO

Vários estudos tem demonstrado que a irradiação do laser de baixa potência acelera o processo de reparo em músculos lesionados,  um achado em nossos resultados que está em acordo mostra que a laser terapia nas doses de 10 e 50J/cm2 resultaram em mais fibras musculares organizadas e diminuição do infiltrado inflamatório comparado com os controles após 7 e 14 dias.

 Silva et. Al avaliou o efeito do GaAs laser de 904nm e reportou que em 5 dias de aplicação na dose de 3J/cm2 acelerou o processo de reparo muscular.

Iyomasa et al. Analisou o efeito do HeNe lase (633nm) nas doses de 5 ou 10J/cm2 por 7 dias consecutivos e concluiu que ambas dosagens são benéficas para o processo de reparo.

No que diz respeido a área da lesão, os resultados mostraram que após 7 dias, os grupos tratados com laser na dosagem de 10 e 50J/cm2 tem deminuido a lesão em comparação com os controles, assim demonstrando que o laser tem acelerado a fase inflamatória e diminuído o tempo necessário para avançar para as próximas etapas do processo de regeneração muscular: reparo muscular e remodelamento muscular. Outros estudos também demonstraram um efeito positivo na fase inflamatória usando a laserterapia.

Após 14 dias, a quantidade de vasos sanguíneos no grupo tratado com laser com dosagem de 10J/cm2 aumentou comparado com o grupo tratado com laser  na dosagem de 50J/cm2.

De acordo com Huard et Al., a regeneração das fibras musculares e crescimento vascular ocorre no período de 7-10 dias após a lesão, com o maior pico ocorrendo na segunda semana e redução na terceira.

Naka et.al relatou  que a angiogenesis da regeneração muscular  quando eles avaliaram a irradiação do laser (830nm, 69mW) para o reparo do musculo atrofiado gastronomic em ratos, reportando um aumento na angiogeneses e proliferação de células satélites.

A angiogeneses possui importante papel na regeneração muscular e é regulado pelo hepatocyte growth fator and vascular endotelial growth fator. Alguns autores reportaram que o laser estimular esses fatores de crescimento tendo um grande potencial myogenico e contribuindo para a neo-angiogeneses, com ativação e proliferação de células satélites.

A miogeneses é controlado por fatores miogênicos regulatórios, (MRFs) entre eles há a MyoD e Myogenin.  O primeiro é responsável pela proliferação de mioblastos e o último regular a diferenciação terminal das células musculares.

Mudanças na expressão do MRFs pode alterar a capacidade de regeneração do tecido muscular.

Na analise da MyoD, nosso estudo demonstrou no grupo tratado com laser na dosagem de 10  e 50J/cm2 7 dias após criolesão possui imunomarcadores de MyoD em maiores concentrações comparado com o controle, ao passo que após 14 e 21 dias, esteve virtualmente ausente.

Souza et al. Concluíram que a MyoD está envolvida no processo de proliferação de células satélites, assim ajudando no processo de reparo muscular. O aumento na quantidade de MyoD nos primeiros dias de reparo muscular é provavelmente relacionado com mais fibras musculares organizadas e diminuição da área da lesão, ambos observados no grupos submetidos com a laserterapia.

Nossos resultados demonstraram imunimarcodores de myogenin esteve presente em todos os 3 grupos experimentais após 7 e 14 dias da criolesão, mas ausente após 21 dias.

Portanto, a terapia com laser de baixa potência (comprimento de onda 780nm, doses de 10 e 50J/cm2) não possui efeito nos imunomarcadores de myogenin, que são essenciais durante a diferenciação e fusão de mioblastos como a MyoD é incapaz de substituir a função da miogenina durante a diferenciação.

Fuchbauer e Wesphal analisaram a expressão da MyoD e miogenin na regeneração do músculo esquelético e reportaram a sua presença por aproximadamente 2 semanas, um encontrado  e corrobora com nossos resultados, desde que ambas myogenina e MyoD não forem expressadas após 21 dias, provavelmente devido ao fato do reparo estar concluído nessa fase.

Nossos resultados sugerem que o efeito LLLT somente aumenta o processo de reparo muscular nos dois primeiros períodos, provavelmente durante 21 dias, o musculo já estará reparado e o laser não possui efeito no musculo reparado. Isso demonstra que o laser usado nas doses de 10 e 50J/cm2 pode acelerar o processo de reparo muscular, um importante achado que motiva a escolha pelo uso da baixa potência especialmente em casos que a aceleração do processo de reparo é necessário.

CONCLUSÃO
Nossos resultados demonstraram que a terapia com o laser de baixa potência, independente da dosagem usada, possui efeitos benéficos na regeneração de fibras musculares como um aumento da concentração de imunomarcadores de MyoD, fibras musculares mais organizadas , aceleração do processo inflamatório, e redução da área lesionada.