2.3 Metaloproteinases da Matriz (MMPs)
Segundo
Birkedal-Hansen (1993) a degradação da matriz extracelular
envolve
mecanismos distintos sendo iniciada pela dissolução mediada por
metaloproteinases
da matriz (MMPs) ou pela plasmina.
A
regulação do turnover das macromoléculas da matriz extracelular é crítica
para
uma série de processos biológicos importantes, sendo realizada por enzimas
proteolíticas
extracelulares excretadas localmente pelas células que pertencem a
uma
de duas classes: as metaloproteases ou as serinoproteases (ALBERTS et al.,
1997;
GRENIER; MAYRAND, 2001; PEREIRA et
al., 2005; SORSA;
TJÄDERHANE;
SALO, 2004).
Sternlicht
e Werb (2001) explicam que as enzimas proteolíticas são
classificadas
em exopeptidases e endopeptidases quando clivam,
respectivamente,
ligações terminais ou internas dos peptídios.
As
metaloproteinases são um grupo de endopeptidases, dependentes de
Ca++ ou Zn++ ligados no sítio ativo para possuírem atividade (ALBERTS et al.
1997)
classificadas em 5 superfamílias, sendo uma delas a superfamília metzincin
que
contém um domínio com 3 histidinas que se ligam ao zinco no sítio catalítico.
A
superfamília metzincin é subdividida em 4 famílias: as serralisinas, as astacinas,
as
ADAMs (adamalisinas) e as metaloproteinases da matriz (MMPs) (MOTT;
WERB,
2004; STERNLICHT; WERB, 2001).
As
MMPs são uma família de enzimas proteolíticas que degradam os
componentes
da matriz extracelular como o colágeno, a gelatina e a elastina
(HAAKE
et al.,
2004). As MMPs dos vertebrados atuam em diversos substratos,
sendo
capazes de degradar virtualmente todos os componentes da matriz
extracelular
(De SOUZA et al.,
2005; STERNLICHT; WERB, 2001).
Como
a cada momento são descobertos novos membros da família das
MMPs,
é difícil dizer com segurança quantas enzimas existem. Birkedal-Hansen
(1993)
afirma que a família dos genes MMP codificam pelo menos nove
endopeptidases
metal-dependentes.
Sternlicht
e Werb (2001) afirmam que, até aquele ano, foram identificadas
25
MMPs nos vertebrados e 22 homólogos em humanos, além de outras nos
invertebrados.
Em 2002, De Souza e Line afirmaram que até aquele momento
existiam
pelo menos 16 MMPs humanas caracterizadas.
Rundhaug
(2003) afirma que as MMPs são uma família de mais de 20
endopeptidases
que contém zinco capazes de degradar vários componentes da
matriz
extracelular. Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmam que as MMPs
correspondem
a uma família 23 de enzimas que degradam componentes da
matriz
extracelular, incluindo as membrana basais.
Todas
as MMPs são derivadas de um protótipo estrutural com cinco
domínios
onde pela adição ou deleção de um ou mais domínios tem-se as
variadas
formas de MMP com suas particularidades. Todas as formas contêm um
sítio
de ligação para um Zn++ que se acredita
que constitua o sítio ativo da enzima
(BIRKEDAL-HANSEN,
1993; De SOUZA et al.,
2005; PEREIRA et al.,
2005;
REYNOLDS;
MEIKLE, 1997; RUNDHAUG, 2003; STERNLICHT; WERB, 2001).
As
metaloproteinases são referidas de acordo com nomes específicos ou
por
uma numeração e agrupadas de acordo com a sua estrutura (NABESHIMA et
al., 2002).
Cotrim
et al.,
em 2002, as classificam em 4 grupos principais, o das
colagenases
intersticiais, o das colagenases tipo IV, o das estromelisinas e o das
MMPs
ligadas à membrana.
Segundo
Rundhaug (2003) as MMPs existem na forma solúvel (MMP-1, -3,
-8,
-10, -12, -13, -19 e -20, por exemplo) e na forma ligada à membrana, com um
domínio
trans-membrana e uma curta cauda citoplasmática, sendo então
chamadas
de MT-MMPs (MT1-, MT2-, MT3-, MT4- e MT5-MMP).
De
Souza e Line (2002) e Pereira et
al. (2005) listam algumas das MMPs
humanas
catalogadas, de acordo com o substrato em que atuam, como
colagenases
(MMP-1, -8 e -13), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3
e
-10), metaloelastase (MMP-12), enamelisina (MMP-20) e metaloproteinases
ligadas
à membrana plasmática (MMP-14, -15, -16, -24, -17, -25 e -23).
Para
que a degradação seja controlada rigorosamente, vários mecanismos
de
regulação atuam como a secreção das proteases como precursores inativos,
pró-enzimas
ou zimogênios, a ação de inibidores teciduais de metaloproteases
(TIMPs)
e os inibidores de serinoproteases (serpinas) (ALBERTS et al. 1997).
Na
maioria dos casos as MMPs não são sintetizadas até serem necessárias
e a
sua transcrição pode ser induzida por sinais como citocinas, fatores de
crescimento
e estresse mecânico. A ativação das MMPs ocorre por ação de
proteases
séricas como plasmina e funina e, como acontece com algumas MMPs,
por
ação de outras MMPs que podem ativar outros membros da família como a já
conhecida
ativação da MMP-2 pela MT1-MMP que se dá pela remoção de um
pró-domínio
resultando em uma forma ativa, geralmente de peso molecular menor
(RUNDHAUG,
2003; SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).
Regulação
adicional da atividade das MMPs é exercida por inibidores
endógenos
como a a2-macroglobulina
e os inibidores teciduais de
metaloproteinases
(TIMPs). As TIMPs são em número de 4 (TIMP-1, -2, -3 e -4) e
sabe-se
que além de exercer atividade de inibição das MMPs, também participam,
em
alguns casos, no processo de sua ativação como no caso da TIMP-2 que é
necessária
para a ativação da pró-MMP-2 pela MT1-MMP (RUNDHAUG, 2003,
SORSA;
TJÄDERHANE; SALO, em 2004).
A
inibição das MMPs é também possível através de produtos sintéticos
como
os quelantes do íon Zn2+, como batimastat e marimastat, e
através do uso
de
tetraciclinas que possuem o potencial de inibir as MMPs por mecanismos como
inibição
da expressão do RNAm para MMPs, interferir com o processo de ativação
da
pró-enzima e tornar a MMP ativada mais susceptível à degradação (SORSA;
TJÄDERHANE;
SALO, 2004).
Segundo
Birkedal-Hansen (1993) a atividade das MMPs é regulada pelo
próprio
processo de transcrição dos genes que as codificam, pela ativação de
precursores,
pela diferença na especificidade dos substratos e por inibidores. A
regulação
transcricional é mediada por citocinas, como as interleucinas e fatores
de
crescimento, e por hormônios como o paratormônio os quais têm a capacidade
de
estimular a transcrição de algumas e inibir as de outras. Componentes
microbianos
como os LPS e lectinas possuem também a capacidade estimular a
transcrição
de certos tipos de colagenases. A regulação através da ativação de
precursores
se dá pela ruptura da ligação de um resíduo Cys do propeptídio do
sítio
ativo contendo o Zn++. Alguns
inibidores têm também a capacidade de regular
a
ação das MMPs, são eles as a-macroglobulinas
e os Inibidores teciduais de
metaloproteinases
(TIMPs). As a-macroglobulinas têm a capacidade de capturar
as
moléculas de MMP através de ligações específicas. Os TIMPs, formam
complexos
bimoleculares não covalentes com formas ativas ou latentes de MMPs.
Diferentes
células produzem e liberam MMPs de diferentes maneiras. O padrão de
resposta
da MMP dos PMNs é singular devido ao armazenamento em grânulos e
liberação
rápida levando a um substancial aumento nos níveis destas enzimas em
questão
de minutos, mantendo a resposta pelo recrutamento de novas células se
o
estímulo permanece.
Reynolds
e Meikle (1997) relatam que a ativação das MMPs é mediada por
fatores
como a plasmina, capaz de ativar a colagenase e a estromelisina-1. A
estromelisina
também pode participar da ativação de outras MMPs como a MMP-9
(gelatinase-B)
e a colagenase. Alguns produtos exógenos como os
lipopolissacarídeos
(LPS) liberados pelas bactérias do biofilme dentário podem
ativar
colagenases. A MMP ligada a membrana (MT1-MMP ou MMP-14) também
participa
no processo de ativação de colagenases.
Sternlicht
e Werb (2001) relatam que para exercerem sua função, nos
processos
fisiológicos ou patológicos, as MMPs precisam estar presentes no tipo
celular
e região pericelular no momento certo, na quantidade certa e precisam ser
ativadas
ou inibidas apropriadamente. São, portanto, fortemente reguladas nos
níveis
transcricional e pós-transcricional, assim como no nível protéico por
ativadores,
inibidores e por sua localização na superfície celular. A maioria das
MMPs
são reguladas no nível transcricional e estabilização pós-transcricional do
RNAm.
Quanto à secreção, a maioria das MMPs são secretadas tão logo seja
traduzido
o seu RNAm, sendo então constitutivas do tecido, no entanto, a MMP-8
e a
MMP-9 podem ser sintetizadas por granulócitos na medula óssea sendo
armazenadas
em grânulos dos neutrófilos circulantes e liberadas quando estes
são
ativados por mediadores inflamatórios.
Segundo
Birkedal-Hansen (1993) a colagenase dos PMN são liberadas de
grânulos
específicos existentes nestas células quando estas são ativadas
enquanto
que as dos fibroblastos são transcritas de acordo com a demanda. O
grupo
das estromelisinas atuam em diversos substratos como a proteína núcleo
das
proteoglicanas, colágeno tipos IV e V, fibronectina e laminina e é expressada
por
células estromais mediante estímulos por citocinas como o IL-1, o EGF e o
TNF-a. As gelatinases são talvez as mais distribuídas das MMPs e podem
ser
produzidas
por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, monócitos/
macrófagos,
osteoblastos e condrócitos. Algumas formas de gelatinases podem
ser
expressas por PMNs. Além da proteína gelatina, estas enzimas podem clivar
elastina
e colágeno dos tipos IV, V, VII e X.
Segundo
Wahl e Corcoran (1993) as lesões inflamatórias crônicas são
povoadas
por células mononucleares como monócitos e macrófagos, portanto
estas
células podem ser importantes fontes de mediadores da destruição tecidual.
Já
foi demonstrado que estas células são capazes de produzir várias
metaloproteinases
da matriz como colagenases que degradam colágenos I, II e III,
colagenase
de 92 kDa capazes de degradar gelatina e colágenos tipo IV e V e
estromelisina
que degrada a fibronectina, as proteoglicanas, e a laminina e os
colágenos
IV e V. A produção de metaloproteinases por estas células é
dependente
de ativação primária por substâncias como lipopolissacarídeos
bacterianos
(LPS), concanavalina A (Con A) e linfocinas que levam à produção de
prostaglandina
E2 (PGE2) e AMP cíclico (cAMP) intracelular.
De
acordo com De Souza e Line (2002) fibroblastos gengivais,
ceratinócitos,
macrófagos e leucócitos polimorfonucleares são capazes de
expressarem
MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8 e MMP-9.
Tanto
a MMP-1 quanto a MMP-8 são colagenases, sendo que a MMP-8 é
liberada
por neutrófilos infiltrados enquanto a MMP-1 é expressada por
fibroblastos,
monócitos, macrófagos e células epiteliais (HAAKE et al. 2004a).
A
MMP-1, ou colagenase 1, é uma enzima com 52 kDa na forma inativa e
41
kDa na forma ativa que é expressa in
vivo em áreas de rápida remodelação
tecidual
fisiológica ou patológica. É expressa por fibroblastos, ceratinócitos,
condrócitos,
monócitos, macrófagos, hepatócitos e uma variedade de células
tumorais.
Os substratos já identificados desta enzima são os colágenos dos tipos
I,
II, III, VII, VIII e X, além de agrecana, serpins e a2-macroglobulina (NABESHIMA
et al., 2002; WESTERMARCK;
KÄHÄRI, 1999). Lynch e Matrisian (2002) relatam
que
além destes substratos a MMP-1 ainda degrada o colágeno tipo XI, gelatina,
entacina,
fibronectina, laminina, tenacina e vitronectina.
A
MMP-1 cliva o colágeno tipo I, que é posteriormente degradado por
outras
enzimas (De SOUZA; LINE, 2002), pois após clivado, o colágeno I
desnatura-se
formando a gelatina que é degradada pela MMP-2 e MMP-9
(COTRIM
et al.
2002; STAMENKOVIC, 2000).
A
MMP-8 é uma colagenase que já teve a sua produção atribuída
exclusivamente
aos neutrófilos, no entanto sabe-se hoje que outras células têm a
capacidade
de produzi-la.
De
acordo com Kubota, T. et al.
(1996), a MMP-1 e a MMP-8 têm
capacidade
de degradar o colágeno tecidual pela clivagem da molécula no
domínio
da tripla hélice resistente à proteinase. A MMP-3, ou estromelisina-1 é um
membro
da família das metaloproteinases com a capacidade de degradar vários
tipos
de substratos como proteoglicanas, fibronectina, laminina e colágenos tipo IV
e
XI.
A
MMP-2, ou gelatinase A, tem 75 kDa na sua forma inativa e 65 kDa na
forma
ativa e a MMP-9, ou gelatinase B, tem 92 kDa na forma inativa e 84 kDa
quanto
ativada (STAMENKOVIC, 2000; WESTERMARCK; KÄHÄRI, 1999).
A
MMP-2 é expressa por uma variedade de células normais ou tumorais
(WESTERMARCK;
KÄHÄRI, 1999) e tem a capacidade de degradar gelatina,
colágenos
dos tipos IV, V e X na sua forma nativa, além de laminina, TGF-b, e
colágenos
dos tipos I, II e III desnaturados (KUBOTA, Y. et al., 2002;
STAMENKOVIC,
2000).
A
produção de MMP-2 ocorre na sua forma inativa, ou Pró-MMP-2 e é
necessário
para que ocorra a sua ativação a ação da MT1-MMP, com a
participação
de uma molécula de TIMP-2 como ponte, formando um complexo
trimolecular
(KUBOTA, Y. et al.,
2002; NABESHIMA et al.,
2002; PATTAMAPUN et
al. 2003).
Kubota,
Y. et al.
(2002) estudando o efeito da IL-1a na ativação de MMP-2
em
fibroblastos isolados de ceratocistos, mostraram que esta citocina tem a
capacidade
de aumentar a produção de MT1-MMP nos fibroblastos, fazendo com
que
a ativação de MMP-2 seja aumentada. Foi sugerido então neste estudo que a
IL-1a, através do aumento da produção de MT1-MMP com maior ativação de
MMP-2
desempenha um papel crucial no crescimento intra-ósseo do ceratocisto.
De
Souza et al.
(2005) descrevem a MMP-9, ou gelatinase B como uma
enzima
expressa por leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, ceratinócitos e
células
endoteliais que atua nos colágenos do tipo IV, V e IX, em proteoglicanas e
na
elastina e tem sua expressão controlada por fatores como o TNF-a, a IL-1, o
PDGF
e o EGF.
Stamenkovic
(2000), relata que a MMP-9 tem a capacidade de degradar
gelatina,
colágenos do tipo I, IV, V e X, além de TGF-b na forma latente.
Assim
como a MMP-2, a MMP-9 também é produzida na sua forma inativa
no
entanto o seu mecanismo de ativação in vivo ainda não está completamente
elucidado
(KUBOTA, Y. et al.,
2000; KUBOTA, Y. et al.,
2002). Van Den Steen et
al. (2002) afirmam que ela é ativada
principalmente por outras MMPs.
A
MMP-9 atua na biologia óssea de maneira a participar na regulação do
turnover ósseo mas
quando desregulada na sua síntese, secreção ou ativação
resulta
em reabsorção óssea patológica (Van Den STEEN et
al., 2002).
Kubota,
Y. et al.
(2000) estudaram o mecanismo de expansão dos cistos
odontogênicos
enfocando os efeitos da IL-1a na
secreção e ativação de MMP-9. A
análise
zimográfica mostrou a presença da gelatinase de 92 kDa, a forma inativa
da
MMP-9 em fluidos coletados de cistos dentígeros e cistos radiculares e de 83
kDa,
a MMP-9, ativa principalmente em ceratocistos. Fragmentos cultivados dos
cistos
coletados mostraram produção de MMP-9, além de MMP-2, quando
incubados
com IL-1a além de ativação de Pró-MMP-9 em MMP-9.
Chang
et al.
(2002) publicaram trabalho que teve o objetivo de determinar
os
efeitos das bactérias Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis
na
produção e secreção de metaloproteinases da matriz em culturas de células do
ligamento
periodontal. Células de polpas dentárias e de ligamento periodontal
humanos
foram obtidas de terceiros molares retidos e então cultivadas. A análise
zimográfica
mostrou que a enzima MMP-2 começou a aumentar a partir do quarto
dia
de cultura de células pulpares com P.
endodontalis e P.
gingivalis e continuou
aumentando
até o oitavo dia de forma dose-dependente. A MMP-9 também foi
detectada
na análise zimográfica mas em pequena quantidade. Na cultura de
células
do ligamento periodontal ocorreu efeito semelhante. Este estudo mostra
que
o P. endodontalis e o P. gingivalis, desempenham um importante papel na
destruição
tecidual e desintegração da matriz extracelular em lesões pulpares e
periapicais
através da indução das células residentes locais a produzirem MMPs.
Shin
et al.
(2002) realizaram um trabalho com o objetivo de verificar se as
MMP-1,
-2 e -3 estariam aumentadas nos tecidos pulpares inflamados e lesões
periapicais
e a sua distribuição nestes tecidos. Foram obtidas 12 polpas com
diagnóstico
clínico de inflamação aguda, 12 com inflamação crônica, 10 lesões
periapicais
e 10 polpas normais como controle. Foram feitas ELISA e análises
imuno-histoquímica
com anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-MMP3. Os
resultados
mostraram que nas polpas com pulpite aguda, a MMP-1 e a MMP-3 se
localizaram
predominantemente nos neutrófilos e macrófagos, assim como na
matriz
extracelular. As células inflamatórias típicas da inflamação crônica
marcaram
fracamente. A MMP-2 expressou fracamente nas células inflamatórias e
fibroblastos
de todos os grupos experimentais. A MMP-1, -2 e -3 marcaram em
plasmócitos,
linfócitos e macrófagos. Estes resultados sugeriram que a MMP-1 e a
MMP-3
podem ser produzidas por neutrófilos, macrófagos, plasmócitos e
linfócitos.
A produção de MMPs foi maior nas pulpites agudas que nos grupos
controle
o que pode significar que elas participam na progressão da inflamação
pulpar.
Franchi
et al. (2002) avaliaram, em carcinomas de cabeça e pescoço, a
expressão
imuno-histoquímica da MMP-1, MMP-2 e MMP-9 correlacionando estes
dados
com o estado do gene p53, a
atividade da enzima óxido nítrico sintetase e
com
a angiogênese. Fragmentos do front
de invasão de tumores foram obtidos de
43
pacientes e usados para análise imuno-histoquímica e molecular. Os
resultados
mostraram que a expressão das MMPs foi variável e envolveu além
das
células neoplásicas as células endoteliais e inflamatórias. A expressão da
MMP-1
foi evidente em 97,6% dos espécimes, com 74,5% demonstrando
distribuição
moderada ou difusa nas células neoplásicas. A expressão da MMP-2
foi
evidente em 79% com marcação considerada moderada ou difusa em 39,5% e
da
MMP-9 foi evidente em 65% com 39,5% mostrando marcação moderada ou
difusa.
Tumores com superexpressão de MMP-9 foram associados a maior
freqüência
de metástases em linfonodos embora não tenha sido estatisticamente
significante.
A densidade vascular correlacionou-se positivamente com a presença
de
metástases em linfonodos, com tumores primários de maior tamanho e com
superexpressão
de MMP-9. Tumores com mutação de p53
apresentaram maiores
densidades
vasculares e maior quantidade de superexpressão para MMP-9. Os
autores
chamam a atenção para o fato da expressão de MMPs ter sido encontrada
não
só nas células tumorais, como também nas células estromais e nas células
inflamatórias
próximas ao tumor e consideram estas células fontes importantes
destas
enzimas para os tecidos tumorais concluindo então que existe uma forte
correlação
entre a expressão de MMP-9, a mutação do gene p53
e a
angiogênese.
O
papel das MMPs na angiogênese foi discutido por Haas e Madri (1999). A
angiogênese
é dependente da ativação de células endoteliais dando início a
proliferação
celular e proteólise das membranas basais permitindo a invasão e
migração
das células endoteliais através da matriz extracelular para formar novos
vasos.
A degradação da matriz extracelular ocorre pela ação de uma série de
enzimas,
incluindo as MMPs. Células endoteliais já demonstraram ser produtoras
de
MMP-1, MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP provavelmente tendo
grande
importância na angiogênese.
Segundo
Rundhaug (2003) as MMPs são importantes no processo de
angiogênese
já que o primeiro passo da angiogênese é a degradação da
membrana
basal de um vaso pré-existente. Mas as MMPs não contribuem com a
angiogênese
somente pela degradação da membrana basal e de outros
componentes
da matriz extracelular. Atuam também na liberação de fatores próangiogênicos
ligados
à matriz extracelular como bFGF, VEGF e TGFb.
Componentes
da matriz extracelular degradados pelas MMPs tormam acessíveis
sítios
de ligação para determinadas integrinas como a avb3, que podem iniciar
uma
sinalização que contribui para a sobrevivência e proliferação endotelial.
Kumamoto
et al.
(2003) avaliaram a expressão imunohistoquímica das
metaloproteinases
MMP-1, -2 e -9 e dos inibidores TIMP-1 e -2 em
ameloblastomas
comparando-os com germes dentários no intuito de verificar o
seu
papel no processo de invasividade do tumor já que as ação das MMPs e
TIMPs
poderiam estar envolvidos no processo de degradação da membrana basal
dos
ameloblastomas. Espécimes removidos de 22 pacientes com ameloblastomas
foram
analisados imuno-histoquimicamente. Neste estudo, a reatividade das
MMP-2
e -9, associadas à degradação de membrana basal, foi encontrada
preferencialmente
nos componentes mesenquimais que nos epiteliais e a sua
expressão
pode estar associada à regulação epitélio-mesenquimal em tecidos
odontogênicos
tanto normais quanto neoplásicos atuando no processo de
invasividade
dos ameloblastomas e em processos desenvolvimentais nos germes
dentários.
Ao
exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as
MMPs
liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As
MMP-2
e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo
escondido
na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A
degradação
da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP
libera
um fragmento escondido da sua cadeia g2
que é capaz de induzir migração
epitelial.
Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2,
ao
degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um
importante
fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de
crescimento
TGF-b (MOTT; WERB, 2004).
....... Ao exercerem sua atividade na degradação da matriz extracelular, as
MMPs
liberam fragmentos escondidos e neo-epítopos das macromoléculas. As
MMP-2
e -9, por exemplo, ao degradarem a membrana basal expõem um epítopo
escondido
na molécula do colágeno IV capaz de promover angiogênese. A
degradação
da laminina-5, outro componente da membrana basal, pela MT1-MMP
libera
um fragmento escondido da sua cadeia g2
que é capaz de induzir migração
epitelial.
Também já foi demonstrado que a MMP-9 e, em menor grau a MMP-2,
ao
degradarem a matriz extracelular aumentam a biodisponibilidade da VEGF, um
importante
fator de crescimento no processo de angiogênese, e do fator de
crescimento
TGF-b (MOTT; WERB, 2004).